Nguồn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26136869

Tóm tắt.  

Bệnh tiểu đường tuýp 2 (T2D) đặc trưng bởi sự rối loạn chức năng và sự phá hủy các tế bào β, dẫn đến thiếu hụt insulin. Các phương cách mới để bảo tồn các tế bào β còn lại và phục hồi chức năng tế bào β để điều trị bệnh tiểu đường là rất cần thiết. Tế bào gốc trung mô (MSC) đã được khai thác trong nhiều thử nghiệm lâm sàng nhằm mục đích giảm bớt sức ép của bệnh bằng miễn dịch qua trung gian. Mục đích của việc thử nghiệm lâm sàng hiện nay là đánh giá sự an toàn và hiệu quả của việc cấy ghép dây rốn (UCMSC) cho bệnh nhân mắc T2D. Sự an toàn và hiệu quả của ứng dụng UCMSC đã được đánh giá ở sáu bệnh nhân mắc T2D, trong thời gian theo dõi tối thiểu 24 tháng. Sau khi cấy ghép, mức độ C-peptide lúc đói, giá trị cực đại và diện tích dưới đường cong giải phóng peptide C tăng đáng kể trong vòng một tháng và duy trì ở mức cao trong suốt thời gian theo dõi (P <0,05). Ba trong số sáu bệnh nhân bắt đầu không có lượng insulin trong các khoảng thời gian khác nhau, trong khoảng từ 25 đến 43 tháng, trong khi ba bệnh nhân khác tiếp tục phải tiêm insulin, mặc dù nhu cầu về insulin đã giảm. Đường huyết lúc đói và đường huyết 2 giờ sau khi ăn tương đối ổn định ở tất cả các bệnh nhân sau khi cấy ghép. Không có độc tính tức khắc hoặc sau đó có liên quan đến khả năng kiểm soát tế bào trong thời gian theo dõi.

Do đó, kết quả chỉ ra rằng cấy ghép các UCMSC allogeneic có thể là một cách tiếp cận để cải thiện chức năng các tế bào tiểu đảo ở bệnh nhân mắc bệnh T2D. Không có vấn đề về an toàn quan được ghi nhận trong quá trình tiêm truyền và trong thời gian theo dõi dài hạn.

Giới thiệu

Bệnh đái tháo đường là do thiếu hụt insulin tuyệt đối do sự phá hủy tự miễn của các tế bào β tuyến tụy (tiểu đường tuýp 1, T1D) hoặc do thiếu insulin tương đối do giảm độ nhạy insulin (tiểu đường loại 2, T2D). Điều trị cho T1D và T2D thường bao gồm tiêm insulin thường xuyên và thuốc uống với sulfonylurea. Tuy nhiên, phương pháp điều trị này không kiểm soát chính xác lượng đường trong máu, cũng không ngăn ngừa các biến chứng liên quan đến bệnh tiểu đường. Giảm khối lượng tế bào β trong tuyến tụy là dấu hiệu đặc trưng của sự phát triển của bệnh tiểu đường. Tái tạo và duy trì mô nội tiết tuyến tụy sau khi bắt đầu phá hủy tế bào tiểu đảo có thể có tác động điều trị đáng kể đối với bệnh tiểu đường (1). Các liệu pháp cấy ghép cho T1D bao gồm ghép toàn bộ cơ quan, cấy ghép và tái tạo tiểu đảo (2.5).  Sự thành công của giao thức Edmonton trong cấy ghép tiểu đảo tụy đã tạo nên những mối quan tâm mới trong điều trị T1D (3). Tuy nhiên, yêu cầu về miễn dịch và sự khan hiếm các cơ quan có sẵn để xử lý và cấy ghép đã cản trở việc sử dụng rộng rãi liệu pháp này. Do đó, việc tìm kiếm các phương pháp thay thế là mối quan tâm quan trọng nhất.

 Tương ứng: Bác sĩ Long Jun Dai, Khoa Phẫu thuật, Đại học British Columbia, 400828 Đại lộ Tây 10, Vancouver, BC V5Z 1L8, Canada

Bác sĩ Li-Xue Guan, Phòng thí nghiệm Trung tâm, Bệnh viện Nhân dân Weifang, Trường Cao đẳng Y khoa Weifang, 151 Guangwen Street, Weifang, Shandong 261042, P.R. Trung Quốc

*Có đóng góp như nhau

Từ khóa: tiểu đường, tế bào gốc trung mô, tế bào học   Tế bào gốc trung mô (MSC) đã tạo được dấu ấn trong lĩnh vực y học tái tạo, vì chúng có khả năng tăng sinh và biệt hóa thành dòng trung mô, tiết ra nhiều loại cytokine và các yếu tố tăng trưởng, cũng như khả năng ức chế miễn dịch rộng trong ống nghiệm. (6.8). MSC có thể dễ dàng bắt nguồn từ các mô khác nhau và giá trị trị liệu của chúng đã được xác nhận cho một số điều kiện lâm sàng (9). Không giống như các tế bào gốc phôi, việc mua và sử dụng chúng không được coi là vấn đề gây tranh cãi (10). Do đó, đã có các sự quan tâm lớn trong các ứng dụng lâm sàng tiềm năng của MSC (11,12). Ngày càng có nhiều bằng chứng từ các nghiên cứu trên động vật và các thử nghiệm lâm sàng cho thấy hiệu quả điều trị của cấy ghép MSC trong một số bệnh, như nhồi máu cơ tim (13,14), đột quỵ (15), chấn thương tủy sống (16), chấn thương não (17) , lupus ban đỏ hệ thống (1820), bệnh gan (21), đái tháo đường (10,22,23) và ghép cấp tính và Bệnh vật cấy ghép phản ứng lại vật chủ (GVHD) (24,25). Các tế bào gốc trung mô có nguồn gốc từ dây rốn của con người (UCMSCs) có khả năng đa năng lớn hơn so với các tế bào gốc trưởng thành, biểu hiện các dấu hiệu đa năng, ngày 4 tháng 10, Sox2 và cMyc (26), và có cùng đặc tính miễn dịch trong ống nghiệm. MSC thu được từ tủy xương. Tuy nhiên, không giống như tế bào gốc phôi, UCMSC không hình thành khối u khi được cấy ghép (27,28). Hơn nữa, UCMSC là nguồn miễn dịch đặc hiệu, ức chế miễn dịch và sẵn có như một nguồn tế bào, cùng một vài tranh cãi về vấn đề đạo đức (29,30). Do đó, UCMSC có thể cung cấp một nguồn liệu pháp tế bào mới cho bệnh tiểu đường. Tuy nhiên, cho đến nay, rất ít nghiên cứu lâm sàng đã tập trung vào việc điều trị T2D bằng UCMSC. Do đó, nghiên cứu hiện tại báo cáo kinh nghiệm sơ bộ về việc áp dụng truyền tĩnh mạch UCMSCs ở sáu bệnh nhân mắc bệnh T2D.

Các nguyên liệu và phương pháp

Các bệnh nhân ghi danh. Tổng cộng sáu bệnh nhân nam có tiền sử mắc bệnh T2D khác nhau đã được ghi danh vào nghiên cứu trong khoảng thời gian từ tháng 4 năm 2010 đến tháng 12 năm 2011 tại Bệnh viện Nhân dân Weifang (Weifang, Trung Quốc). Đặc điểm lâm sàng của họ được nêu trong Bảng I. Tuổi trung bình khi tiêm truyền là 40,5 ± 3,76 tuổi (khoảng 2751 tuổi) và thời gian trung bình từ khi có triệu chứng tăng đường huyết đến khi cấy ghép (lần truyền đầu tiên) là 64,7 ± 23,8 tuần (khoảng, 457 tuần). Tất cả những bệnh nhân trước đây đã được điều trị bằng cách tiêm insulin. Mặc dù đã được điều trị, nồng độ glucose và glycated hemoglobin trong máu (HbA1c) của họ được kiểm soát kém và việc tiết insulin tương đối không đủ trong điều kiện kháng insulin trước khi truyền. Quy trình nghiên cứu đã được đánh giá và phê duyệt bởi Ủy ban Đạo đức Y khoa của Bệnh viện Nhân dân Weifang trực thuộc Trường Cao đẳng Y tế Weifang, dưới sự bảo trợ của Dự án Kế hoạch Phát triển Khoa học và Công nghệ của Weifang. Trước khi cấy ghép, tất cả các bệnh nhân đã được thông báo về quá trình truyền dịch UCMSC và tình nguyện điều trị nhận bằng phương pháp này. Đã thu văn bản đồng ý từ tất cả các bệnh nhân. Các tiêu chí loại trừ như sau: i) Bệnh kèm theo nghiêm trọng, chẳng hạn như rối loạn chức năng tim phổi, thận hoặc gan, hoặc nhiễm trùng hệ thống; ii) mức bạch cầu, tiểu cầu hoặc huyết sắc <3.0×109/l, 75×109/l và tương ứng 100 g/l; huyết thanh dương tính với HIV, kháng nguyên bề mặt của viêm gan B (HBV; HBsAg), viêm gan C (HCV) hoặc các dấu hiệu khối u; iv) không sẵn lòng tham gia thử nghiệm lâm sàng; v) đã có thực hiện thử nghiệm lâm sàng khác trước đó trong ba tháng qua; vi) phụ nữ mang thai hoặc cho con bú; vii) tiền sử dị ứng nặng; và viii) các điều kiện lâm sàng khác mà các nhà điều tra cho là không phù hợp để ghi danh vào nghiên cứu này.

Chuẩn bị cho UCMSC. Các mẫu dây rốn được thu thập từ các bệnh nhân mổ lấy thai đủ tháng với sự đồng ý của họ, và được sự chấp thuận của Bệnh viện Nhân dân Weifang. Tất cả các thủ tục được thực hiện theo hướng dẫn của Ủy ban Đạo đức Y tế của Cục Y tế (31). UCMSC được phân lập từ mô gelatin bao quanh tĩnh mạch và động mạch. Ngoài ra, một mẫu 10 ml máu cuống rốn được đem phân tích các bệnh truyền nhiễm bao gồm HBV, HCV, HIV, cytomegalovirus (CMV) và giang mai. Các dây rốn không có virus đã được chuyển đi để chuẩn bị tế bào trong phòng thí nghiệm với điều kiện sản xuất tốt. Nói ngắn gọn, nuôi cấy sơ cấp được bắt đầu bằng cách gieo hạt mô băm nhỏ (23mm3 ) vào các đĩa 100 mm trong môi trường tăng trưởng, có chứa α-MEM (Gibco Life Technologies, Carlsbad, CA, Hoa Kỳ), được bổ sung 10% huyết thanh thai bò (FBS), yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi cơ bản 10 ng/ml (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, Hoa Kỳ), penicillin 50 IU/ml và streptomycin 50 µg/ml. Các UCMSC được ủ ở 37˚C trong môi trường khí ẩm 5% CO2. Khi các tế bào đạt tới 7080% hợp lưu (~ 10 ngày), chúng được thu hoạch với mức 0,25% trypsin (Gibco Life Technologies) và được nuôi cấy với cùng một môi trường nuôi cấy. Ngoài ra, một mẫu 30 ml máu tĩnh mạch được thu thập từ những người tham gia để chiết xuất huyết thanh (5810R; Eppendorf, Hamburg, Đức). Mẫu máu được cho phép đông máu bằng cách để nó không bị xáo trộn ở nhiệt độ phòng trong 15-30 phút, và sau đó, huyết thanh được chiết xuất bằng cách quay với tốc độ 2.000 x g trong 10 phút trong máy ly tâm được làm lạnh.

Sau hai lần nuôi cấy, FBS đã được loại bỏ khỏi môi trường nuôi cấy và thay thế bằng huyết thanh tự trị 3%. UCMSC tại các đoạn 35 đã được sử dụng trong nghiên cứu. Để đảm bảo chất lượng của UCMSC, sự phát triển của tế bào thường xuyên được kiểm soát trong quá trình nuôi cấy. Khả năng tồn tại của tế bào của UCMSC thu hoạch được xác định bằng thử nghiệm xanh trypan. Tóm lại, huyền phù tế bào được pha loãng theo tỷ lệ 1: 1 bằng dung dịch xanh trypan 0,4% (Phòng thí nghiệm Bio Rad, Thượng Hải, Trung Quốc) và được ủ ở nhiệt độ phòng trong 12 phút. Tỷ lệ tế bào không thể sống được (màu xanh) được đánh giá bằng cách đếm các tế bào dưới kính hiển vi.

UCMSC được sử dụng để điều trị đã qua các xét nghiệm kiểm soát chất lượng, bao gồm xác định khả năng miễn dịch và phân tích vi sinh.  Nhóm biệt hóa (CD) đã được xác định để nhận dạng mô hình miễn dịch của UCMSCS, bao gồm CD34, CD44, CD45 và CD90. Các kháng thể CD kết hợp chất phát huỳnh quang fluorescein isothiocyanate (FITC) và các mẫu tương ứng của chúng được mua từ eBioscatics (San Diego, CA, Hoa Kỳ) và được sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các tế bào được phát hiện bằng phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy với FACScan EPICS XL ADC (Beckman Coulter, Hoa Kỳ) như mô tả trước đó (32). Các xét nghiệm vi sinh thường quy cũng được thực hiện trước khi ghép tế bào, bao gồm xét nghiệm nội độc tố, vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí và nấm. Các tế bào bị nhiễm độc đã được loại bỏ trong quá trình nhận định.

Cấy ghép UCMSC. USMSC được sử dụng để cấy ghép được thu thập giữa các đoạn 3 và 5, tùy thuộc vào tình trạng tăng trưởng tế bào của từng mẫu. Khoảng 106 UCMSC/kg trọng lượng cơ thể đã được ngâm trong nước muối (40 ml) và được lọc qua bộ lọc tế bào (40 µm; BD Falcon, BD Bioscatics, Bedford, MA, Hoa Kỳ). Truyền dịch được tiêm qua tĩnh mạch sinh dục trong hơn 15 phút và bệnh nhân được xuất viện sau 6 giờ quan sát. Mỗi bệnh nhân được điều trị bằng UCMSC hai lần trong khoảng thời gian hai tuần. Các bệnh nhân đều có giới tính phù hợp với trẻ sơ sinh cho dây rốn.


Đánh giá hiệu quả và theo dõi. Nồng độ glucose huyết tương lúc đói (FPG) được kiểm tra hàng ngày trong 3 tháng, sau đó là kiểm tra hàng tuần thêm thời gian 3 tháng.  Yêu cầu insulin ngoại sinh được điều chỉnh kịp thời theo mức độ FPG. Liều và thời gian sử dụng insulin hàng ngày đã được kiểm tra và ghi lại cho tất cả các bệnh nhân trong toàn bộ thời gian nghiên cứu. Thử nghiệm dung nạp glucose đường uống được thực hiện bằng cách sử dụng tải lượng glucose 75g tiêu chuẩn và các mẫu máu được thu thập ở 0, 0.5, 1 và 2 giờ sau khi thử dung nạp. Vùng dưới đường cong (AUC) liên quan đến mức độ C-peptide trong thử nghiệm dung nạp glucose đường uống trong 2 giờ được tính theo công thức sau: AUC = 0.25 x (giá trị khi đói) + 0.5 x (giá trị trong 0.5h) + 0.75 x (giá trị trong 1h) + 0.5 x (giá trị trong 2h) (33). Tất cả các thông số liên quan đều được theo dõi thường xuyên, bao gồm mức độ C-peptide lúc đói và trong 2 giờ, mức HbA1c, giá trị cực đại của C-peptide trong thử nghiệm dung nạp glucose đường uống 75 g (Cmax), AUC và mức độ của kháng thể decarboxylase axit glutamic (GAD-Ab), Kháng thể tế bào đảo (ICA) và kháng thể tự động insulin (IAA).

Những thay đổi tạm thời về nhu cầu insulin ngoại sinh được ghi nhận tại đường cơ sở (trước khi điều trị) và tại thời điểm 1, 3, 6, 12, 18 và 24 tháng sau khi cấy ghép. Ngoài ra, các biến chứng cấy ghép đã được ghi lại theo thủ tục. Đặc điểm lâm sàng, bao gồm chỉ số khối cơ thể, thời gian mắc bệnh và biến chứng tiểu đường cũng được ghi nhận (Bảng I). Thời gian theo dõi là khác nhau đối với mỗi bệnh nhân do thời gian đăng ký bệnh nhân khác nhau, tuy nhiên, cần tối thiểu thời gian theo dõi 24 tháng cho nghiên cứu hiện tại.

Đường huyết được đo bằng máy đo đường huyết (OneTouch Ultra2, LifeScan, Milpitas, CA, Hoa Kỳ) và nồng độ C-peptide huyết thanh được phát hiện bằng cách sử dụng xét nghiệm miễn dịch hóa phát quang với bộ dụng cụ thương mại (DiaSorin S.P.A., Saluggia, Ý).  Nồng độ HbA1c được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (Shanghai Huachen Medical Technology, Co., Ltd., Thượng Hải, Trung Quốc). Việc phát hiện nồng độ GADAb, ICA và IAA trong huyết thanh đã được tiến hành bằng cách sử dụng bộ dụng cụ tự động kháng thể tế bào đảo tổng hợp (TShenzhen Sciarray BioTech Co., Ltd., Thâm Quyến, Trung Quốc) tại phòng thí nghiệm nội tiết lâm sàng của Bệnh viện nhân dân Weifang.

Đánh giá an toàn của phương pháp trị liệu UCMSC. Các phép đo lâm sàng, xét nghiệm và X quang được sử dụng để đánh giá sự an toàn của liệu pháp cấy ghép UCMSC. Phản ứng tức thì bao gồm sốt, suy hô hấp, đau đầu và biến chứng toàn thân (nhiễm trùng toàn thân), trong khi các phản ứng chậm trễ bao gồm hình thành khối u. Việc kiểm tra được tiến hành trước và sau cấy ghép sau 1, 3, 6, 12, 18 và 24 tháng. Các đánh giá bao gồm xét nghiệm máu và nước tiểu thông thường, đánh giá chức năng gan và thận và phân tích hàm lượng lipid máu. Ngoài ra, sự xuất hiện khối u trong huyết thanh đã được đánh giá bao gồm α-fetoprotein, kháng nguyên carcinoembryonic, kháng nguyên carbohydrate 125 và kháng nguyên carbohydrate 199. Các nhiễm HBV, HCV, HIV, CMV và giang mai cũng được phân tích. Cuối cùng, dùng điện tâm đồ, kiểm tra tia X ngực và siêu âm Doppler màu bụng.

Phân tích thống kê. Dữ liệu lâm sàng và sinh hóa được biểu thị bằng trung bình sai số chuẩn, và so sánh các thay đổi từ các điều kiện cơ bản được phân tích bằng thử nghiệm t của Sinh viên (hai đuôi, ghép nối). Sự khác biệt giữa các nhóm và thời gian theo dõi sau khi ghép (1, 3, 6, 12, 18 và 24 tháng) được xác định bằng phân tích phương sai một chiều. Dữ liệu cơ sở đã được báo cáo riêng lẻ ở dạng bảng. Tất cả dữ liệu được phân tích bằng phần mềm SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, Hoa Kỳ) và P<0,05 được xem là đã cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.


Bảng II. Liều insulin của từng bệnh nhân (IU/kg/ngày).

Bệnh nhân

Tháng 0

Tháng 1

Tháng 3

Tháng 6

Tháng 12

Tháng 18

Tháng 24

1

0.225

0.17

0

0

0

0

0

2

0.296

0.26

0.2

0.24

0.25

0.279

0.298

3

0.779

0.602

0.56

0.71

0.78

0.8

0.82

4

0.405

0.28

0.16

0

0

0

0

5

0.267

0.14

0.03

0

0

0

0

6

0.619

0.52

0.56

0.58

0.633

0.74

0.915

Trung bìnha

0.432±0.090

0.329±0.077

0.252±0.102

0.255±0.130

0.277±0.143

0.303±0.154

0.339±0.174

Kết quả được biểu thị bằng giá trị trung bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình.

Hình 1. Phân lập và xác định các tế bào gốc trung mô cuống rốn (UCMSCs). (A) Xuất hiện các UCMSC sau khi vượt lên (thanh tỷ lệ, 100 µm).

(B) Xác định các UCMSC đoạn thứ ba cho thấy biểu hiện dương tính của CD44 (97,1%) và CD90 (95,8%) và biểu hiện âm tính của CD34 (3,0%) và CD45 (0,04%), như được phân tích bằng phương pháp tế bào theo dòng chảy. FITC, chất phát huỳnh quang fluorescein isothiocyanate.

 

Kết quả

Đặc điểm bệnh nhân. Tổng cộng, sáu bệnh nhân trong độ tuổi từ 27 đến 51 tuổi (trung bình, 40,5 ± 3,76 tuổi) đã được ghi danh vào nghiên cứu. Tất cả các bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh T2D dựa trên các tiêu chí của Tổ chức Y tế Thế giới (34), với thời gian tử vong trung bình là 42,7 ± 13,02 tháng. Liều UCMSC trung bình (bao gồm cả lần truyền đầu tiên và thứ hai) là 0.88±0.05×106 tế bào/kg  (phạm vi 0.79‑0.95×106/kg). Khoảng cách trung bình giữa lần tiêm truyền thứ nhất và lần thứ hai là 15,3 ± 0,49 ngày và thời gian theo dõi thay đổi trong khoảng từ 24 đến 44 tháng (trung bình 33,2 ± 2,82 tháng). Bệnh nhân 5 và 6, người đã thử nghiệm huyết thanh dương tính với GAD‑Ab

trước khi điều trị, đã cho kết quả âm tính 1 tháng sau khi cấy ghép – duy trì trong 24 tháng. Nồng độ ICA và IAA huyết thanh âm tính ở tất cả các bệnh nhân trước và sau cấy ghép. Bệnh nhân 1, 4 và 5, người được chẩn đoán mắc bệnh nhiễm toan ceton đái tháo đường, đã vượt qua tình trạng này sau 1 tháng sau khi ghép UCMSC. Bảng I phác thảo các thông số liên quan đến bệnh tiểu đường của tất cả các bệnh nhân liên quan trước khi dùng trị liệu USMSC.

Thuộc tính của UCMSC. Sử dụng phương pháp gắn kết mô nuôi cấy mô rốn, các UCMSC chính được phân lập thành công từ thạch của Wharton trong dây rốn của con người. Các UCMSC thể hiện hình thái nguyên bào sợi điển hình (Hình 1A), và khả năng sống của tế bào là ≥85%, như được xác định bằng xét nghiệm xanh trypan. Mỗi chế phẩm đều âm tính đối với các vi sinh vật gây bệnh, bao gồm cả vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí và nấm. Endotoxin là ≤0.25 EU/ml trong phần nổi của mỗi chế phẩm tế bào. HBsAg, HCV‑Ab, HIV‑Ab, xét nghiệm kháng thể kháng CMM và giang mai ở người đều âm tính. Ở đoạn 3, các tế bào nuôi cấy cho thấy biểu hiện tích cực của CD44 và CD90 (> 90%) và biểu hiện âm tính của CD34 và CD45

 

Bảng III. Kết quả kiểm tra chủ yếu ở phòng thí nghiệm.

Hạng mục KT

Đường cơ sở

Tháng 1

Tháng 3

Tháng 6

Tháng 12

Tháng 18

Tháng 24

P‑value

WBC (x109/l)

6.83±0.41

6.47±0.36

6.70±0.35

6.63±0.38

6.77±0.40

6.70±0.39

6.72±0.37

>0.05

N (x109/l)

5.21±0.22

5.08±0.20

5.30±0.32

5.19±0.30

5.32±0.27

5.26±0.23

5.31±0.33

>0.05

L (x109/l)

2.30±0.13

2.11±0.10

2.32±0.12

2.25±0.11

2.31±0.13

2.33±0.14

2.22±0.12

>0.05

Hb (g/l)

132.1±2.9

133.3±2.7

130.6±2.5

134.1±2.8

132.8±2.6

134.3±2.2

133.5±3.0

>0.05

PLT (x109/l)

218.8±14.2

220.6±10.7

217.3±12.1

212.9±11.1

222.3±14.4

220.7±13.5

221.9±11.2

>0.05

ALT (U/l)

22.5±2.0

22.0±1.7

23.4±2.3

21.9±1.6

23.0±2.1

22.4±1.9

23.1±2.2

>0.05

AST (U/l)

21.6±1.7

22.5±2.1

23.0±2.0

22.5±2.2

21.8±1.9

23.0±2.3

22.6±2.1

>0.05

BUN (mnol/l)

5.23±0.18

5.30±0.13

4.97±0.16

4.99±0.17

5.05±0.18

5.20±0.15

4.98±0.14

>0.05

sCr (µmol/l)

68.5±3.3

67.0±2.8

64.8±3.0

67.5±3.9

66.0±3.1

65.4±3.1

66.1±3.4

>0.05

Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình (n = 6). WBC, bạch cầu; N, bạch cầu hạt trung tính; L, tế bào lympho; Hb, huyết sắc tố; PLT, tiểu cầu; ALT, alanine aminotransferase; AST, aspartate aminotransferase; BUN, nitơ urê máu; sCr, creatinin huyết thanh.; sCr, serum creatinine.

Bảng IV. Bảng kết quả dấu hiệu khối u

Hạng mục KT

Đường cơ sở

Tháng 1

Tháng 3

Tháng 6

Tháng 12

Tháng 18

Tháng 24

P‑value

AFP (ng/ml)

4.52±0.50

4.61±0.42

4.31±0.33

4.67±0.40

3.94±0.26

4.11±0.44

4.45±0.39

>0.05

CEA (ng/ml)

3.32±0.16

3.15±0.26

2.85±0.18

3.03±0.27

2.95±0.20

3.35±0.17

3.22±0.15

>0.05

CA125 (U/ml)

18.5±1.5

17.4±1.3

18.0±1.6

16.9±1.8

17.8±1.5

18.1±1.7

16.8±1.2

>0.05

CA199 (U/ml)

20.5±0.7

21.2±0.9

20.0±0.6

21.1±0.8

20.9±1.0

21.3±0.8

20.3±0.6

>0.05

Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình (n = 6). AFP, α ‑ fetoprotein; CEA, kháng nguyên carcinoembryonic; CA125, kháng nguyên carbohydrate 125; CA199, kháng nguyên carbohydrate 199.

Hình 2. Liều insulin (IU / kg / ngày) dùng cho bệnh nhân tiểu đường tuýp 2 sau khi điều trị bằng tế bào gốc trung mô cuống rốn. * P <0,05, so với tháng 0 (tiền điều trị).

(<3.0%; Hình 1 B), biểu hiện các đặc điểm tương tự như các MSC có nguồn gốc từ tủy xương được báo cáo trước đó ( 17). Những kết quả này phù hợp với đặc điểm miễn dịch của UCMSCs, đã được báo cáo trong các nghiên cứu trước đây (35,36).

Tác dụng điều trị của UCMSC. Bảng II phác thảo liều lượng insulin dùng cho tất cả các bệnh nhân nghiên cứu. Nhu cầu insulin trung bình hàng ngày đã giảm đáng kể sau khi cấy ghép UCMSC (P <0,05, so với tiền điều trị; Hình 2). Three of six patients (1, 4 and 5; 50.0%) Ba trong số sáu bệnh nhân (1, 4 và 5; 50,0%) trở nên không có insulin (được định nghĩa là

nhóm không có insulin) trong toàn bộ thời gian theo dõi (> 24 tháng). Nhu cầu bổ sung insulin của ba bệnh nhân (2, 3 và 6) đạt mức thấp nhất sau 3 tháng (0,252 IU/kg/ngày) sau khi ghép, nhưng sau đó tăng dần trong khoảng từ 12 đến 24 tháng (được xác định là nhóm phụ thuộc vào insulin). Đáng chú ý, các bệnh nhân không có insulin đã được chẩn đoán mắc bệnh nhiễm toan đái tháo đường khi chẩn đoán và bệnh nhân phụ thuộc insulin tiếp tục phải tiêm insulin; tuy nhiên, nhu cầu insulin của họ đã giảm đáng kể trong một thời gian ngắn (6 tháng; Hình 2).

Trong nhóm không có insulin (Hình 3‑ C), sản xuất peptide C, AUC và Cmax đã tăng đáng kể ở 1, 3, 6, 12 và 24 tháng sau khi ghép (P <0,05, so với tiền điều trị), trong khi không có thay đổi quan trọng nào ở nhóm phụ thuộc insulin (P> 0,05, so với tiền điều trị). Hơn nữa, các bệnh nhân không có biểu hiện mức insulin  C‑peptide khi đói, AUC và Cmax cao hơn đáng kể ở các thời điểm theo dõi khác nhau sau khi truyền UCMSC. Mức HbA1c đã được chứng minh là giảm đáng kể 3 tháng sau khi cấy ghép và được duy trì ở mức giảm ổn định trong 24 tháng của giai đoạn theo dõi (P <0,01, so với tiền điều trị).

Ngoài ra, mức đường huyết sau khi ăn của FPG và sau 2 giờ – thu được sau 3 tháng cấy ghép ổn định hơn so với 7 ngày trước khi điều trị. Trong nhóm phụ thuộc insulin, mức HbA1c giảm đáng kể chỉ sau 3 tháng sau khi cấy ghép (P = 0,011, so với tiền điều trị; Hình 3D).

Hình 3. Quá trình thời gian của (A) C ‑ peptide (khi đói), (B) AUC, (C) Cmax và (D) HbA1c ở sáu bệnh nhân tiểu đường loại 2. Trục x biểu thị thời gian liên quan đến quá trình cấy ghép tế bào gốc trung mô cuống rốnAUC, diện tích dưới đường cong (C peptide); Cmax, nồng độ tối đa (C-peptide); HbA1c, huyết sắc tố glycated. Chấm tròn đen, bệnh nhân tránh tiêm insulin sau khi điều trị bằng tế bào trong suốt thời gian theo dõi (được định nghĩa là bệnh nhân không có insulin). Hình vuông màu đen, bệnh nhân cần giảm liều tiêm insulin sau khi điều trị bằng tế bào (được định nghĩa là bệnh nhân phụ thuộc insulin). (A‑C) All (A – C) Tất cả các điểm chấm tròn đen là P <0,05 so với tháng 0 (tiền điều trị) đối với bệnh nhân không có isulin. (D) Tất cả các điểm vuông màu đen là P <0,01 so với tháng 0 (tiền điều trị) đối với bệnh nhân phụ thuộc insulin, ngoại trừ * (tháng 3) là P <0,05 so với tháng 0 (tiền điều trị).

Đánh giá tính khả thi và an toàn trong quản lý MSC. Đánh giá lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh nhân T2D được điều trị bằng UCMSC cho thấy không có trường hợp tử vong hoặc tác dụng phụ liên quan đến tế bào. Ngoài ra, không có độc tính tức thì hoặc về sau liên quan đến quản lý UCMSC trong thời gian theo dõi 24 tháng. Kết quả kiểm tra sinh lý được trình bày trong Bảng III. Không có phát hiện dương tính liên quan đến các virus được thử nghiệm, bao gồm HIV, HBV, HCV, CMV và giang mai, và không có trường hợp nhiễm trùng nào được ghi nhận trong giai đoạn theo dõi. Các dấu hiệu khối u không phát hiện âm tính trước đó có thể phát hiện âm tính sau khi cấy ghép UCMSC (Bảng IV) và không có khối u nào được xác định thông qua kiểm tra hình ảnh ở các bệnh nhân. Trong toàn bộ quy trình, không có thuốc ức chế miễn dịch nào được sử dụng cho ghép UCMSC và không có trường hợp Bệnh vật cấy ghép phản ứng lại vật chủ (GVHD).

Thảo luận

Bệnh tiểu đường đã trở thành nguyên nhân chính gây tử vong ở những người <60 tuổi (37). Bệnh tiểu đường tuýp 2 (T2D) chiếm phần lớn dân số bệnh nhân tiểu đường (> 90%). Kháng insulin và khiếm khuyết trong chức năng tế bào β của tụy được công nhận là những bất thường sinh lý chính tiềm ẩn phần lớn các trường hợp mắc bệnh T2D. T2D là một loại rối loạn phức tạp, bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố di truyền và môi trường. Mặc dù sự phức tạp và không đồng nhất tồn tại trong cơ chế bệnh sinh của T2D, căn bệnh này đặc trưng bởi sự rối loạn chức năng và sự phá hủy các tế bào β, dẫn đến thiếu hụt insulin.

 Phá hủy tế bào β là trung tâm của sự phát triển và tiến triển của T2D, đặc biệt là trong giai đoạn sau của bệnh (38). Sự tiết insulin giảm do tác dụng của glucotoxomatic và lipotox trên các tế bào β tuyến tụy (39). Do đó, nghiên cứu mạnh mẽ đã tập trung vào các cơ chế có thể để thúc đẩy sự mở rộng của các tế bào và tế bào hiện tại từ tế bào gốc nội sinh hoặc ngoại sinh nằm trong tế bào gốc (40,41). Mức C-peptide  được coi là một chỉ số quan trọng về hiệu quả của các liệu pháp mới đối với bệnh T2D. Vì các yếu tố rủi ro di truyền và môi trường có liên quan đến T2D ở người, việc cấy ghép tế bào gốc nội sinh hoặc ngoại sinh có thể có lợi cho bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường (42,43).

Một số nghiên cứu cho thấy các tế bào tủy xương (BMC) và tế bào gốc trung mô (MSC) có thể biệt hóa thành các tế bào tiểu đảo và ảnh hưởng đến sự tái sinh của chúng ở sinh vật (động vật) mắc bệnh tiểu đường (23,44,45). Dong cùng cộng sự (23) đã báo cáo rằng cấy ghép allogeneic có thể làm giảm lượng đường trong máu ở những con chuột thí nghiệm. Một số lượng tương đối nhỏ các MSC được cấy đã sống và sau đó được chuyển hóa thành các tế bào sản xuất insulin trong tuyến tụy của chuột nhận thí nghiệm. Hơn nữa, Banerjee và cộng sự (46) đã điều trị thành công bệnh đái tháo đường do streptozotocin (STZ) với nhiều lần tiêm truyền BMC không phân đoạn; tuy nhiên, các tác giả đã không có đề xuất về một cơ chế phục hồi. Trong nghiên cứu của Lee và cộng sự (47), việc cấy ghép lặp đi lặp lại với số lượng lớn các MSC (2.5×106) gây ra việc điều chỉnh các tế bào tiểu đảo nhỏ tụy và tiểu cầu thận ở chuột không mắc bệnh tiểu đường/béo phì không mắc bệnh tiểu đường do STZ; 

Urbán và cộng sự (22) đã báo cáo rằng quá trình cấy ghép của BMCs không phân nhánh syngene và nuôi cấy syngeneic hoặc allogeneic ‑ MSC mở rộng đã có thể đảo ngược bệnh tiểu đường do STZ ở chuột; tuy nhiên, cả cấy ghép BMC và MSC đều không hiệu quả. Năm 2008, Tsai và cộng sự đã báo cáo rằng UCMSC có khả năng biệt hóa thành các tế bào dòng tụy trong ống nghiệm và hoạt động như các tế bào sản xuất insulin trong ống nghiệm và trong cơ thể sống. Hơn nữa, sau khi ghép các tế bào biệt hóa vào tĩnh mạch cửa của chuột bị tiểu đường bằng ống thông Port-A, lượng đường trong máu đã giảm. Các tế bào sản xuất insulin có chứa C‑peptide và nhân tế bào người đã được quan sát thấy ở gan (48). Trong nghiên cứu của Trivingi và cộng sự (49), năm bệnh nhân bị đái tháo đường tuýp 1 đã được truyền thành công với tủy xương nuôi cấy không phân tách cộng với mô mỡ của con người, insulin, tạo ra các MSC. Không có bất kỳ tác dụng không mong muốn nào được ghi nhận, và nhu cầu insulin giảm 30‑50% với mức tăng 4-26 lần nồng độ C-peptide huyết thanh đạt được, với thời gian theo dõi trung bình là 2,9 tháng.

Theo tìm hiểu mới nhất của chúng tôi, nghiên cứu hiện tại là nghiên cứu đầu tiên sử dụng liệu pháp dựa trên UCMSC cho bệnh nhân T2D. Trong số sáu bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu hiện tại, có ba bệnh nhân đã không còn phụ thuộc với insulin trong thời gian trung bình là 29 tháng, với sự phụ thuộc insulin dài nhất được ghi nhận ở một bệnh nhân trong 43 tháng. Nhóm không có insulin biểu hiện sự gia tăng nồng độ C-peptide (bụng đói, C-peptide AUC và Cmax) trong tối đa 2 năm trong suốt thời gian theo dõi. Sự gia tăng rõ rệt trong sản xuất C-peptide  cho thấy chức năng tế bào β được cải thiện. Tuy nhiên, sáu bệnh nhân mắc T2D tham gia vào nghiên cứu này là không đồng nhất, và một phản ứng lâm sàng khác biệt được xác định với ba bệnh nhân tiếp tục tiêm insulin, mặc dù nồng độ C‑peptide đã được ghi nhận tăng trong tháng đầu tiên sau khi cấy ghép UCMSC. Tuy nhiên, các mức này giảm nhanh sau tháng thứ ba (Hình 4A). Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng khả năng tự đổi mới, khả năng sống sót và khác biệt của tế bào gốc chủ yếu được điều chỉnh bởi môi trường vi mô của chúng (12,50). Ở những bệnh nhân phụ thuộc insulin, tiền sử đái tháo đường dài, tuổi cao hơn, nồng độ C-peptide huyết thanh thấp hơn ở giai đoạn tiền điều trị và bất kỳ biến chứng nào khác có thể cho thấy sự hiện diện của một môi trường vi mô ít có lợi cho các tế bào được cấy ghép, dẫn đến sự phục hồi ngắn hạn của chức năng tế bào β, ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị cấy ghép UCMSC. Mặc dù cần phải theo dõi lâu dài, nhưng kết quả của nghiên cứu hiện tại chỉ ra rằng truyền UCMSC vào tĩnh mạch có lợi cho việc phục hồi chức năng tế bào ở bệnh nhân mắc bệnh T2D.

Ở những bệnh nhân không có insulin, nồng độ C-peptide huyết thanh được chứng minh là liên tục cải thiện, có thể là do chấn thương miễn dịch nhẹ và môi trường vi mô tốt hơn cho UCMSC được cấy ghép ở những bệnh nhân này.  Các Sự thành công của điều trị này có thể giải thích theo hai bước. Đầu tiên, các UCMSC được cấy ghép có thể tạo ra sự tái tạo của insulin tuyến tụy có nguồn gốc từ các tế bào tiết ra. Thứ hai, UCMSC có thể ức chế các phản ứng miễn dịch qua trung gian tế bào T chống lại các tế bào mới hình thành, từ đó có thể sống sót trong môi trường thay đổi miễn dịch này (10,22,51). Việc sử dụng UCMSC để điều trị bệnh lupus ban đỏ hệ thống đã cung cấp bằng chứng bổ sung cho vai trò điều hòa miễn dịch của chúng (52), hỗ trợ chúng trong việc kiểm soát tự miễn dịch và kích viêm. Tuy nhiên, các cơ chế trải qua quá trình tái tạo và các điều kiện thích hợp cho điều trị UCMSC trong bệnh tiểu đường vẫn chưa được hiểu rõ. Hơn nữa, hiệu quả của điều trị này có thể liên quan đến thời gian mắc bệnh tiểu đường, điều kiện môi trường vi mô, các tế bào còn lại, mức độ nghiêm trọng của các biến chứng, thời gian truyền và phương pháp phân bổ UCMSC. Do đó, các nghiên cứu được kiểm soát tốt hơn với số lượng tăng các trường hợp yêu cầu làm rõ hiệu quả và an toàn của truyền tĩnh mạch UCMSC trong điều trị T2D.

An toàn của bệnh nhân và lợi ích tiềm năng đối với tỷ lệ rủi ro luôn là những cân nhắc quan trọng hàng đầu trong thực hành thí nghiệm lâm sàng. Trong nghiên cứu hiện tại, một phương pháp mới trong điều trị T2D đã được thử sử dụng phương pháp ghép UCMSC. Hệ thống theo dõi đã được thực hiện để đánh giá sự an toàn và hiệu quả của liệu pháp UCMSC ở người. Các phép đo an toàn chỉ ra rằng quản lý UCMSC thông qua truyền tĩnh mạch được dung nạp tốt ở liều chỉ định mà không có biến chứng tức thì. Trong thời gian theo dõi, không có phản ứng miễn dịch và không có sự hình thành khối u. Do đó, kết quả chỉ ra rằng tỷ lệ rủi ro lợi ích của trị liệu dựa trên UCMSC trong bệnh T2D dường như là thuận lợi. Quan sát này phù hợp với các nghiên cứu trước đây được thực hiện bởi Shi cùng cộng sự (53) và Lv cùng cộng sự (54), trong đó các kết quả cũng cho thấy rằng cấy ghép với UCMSC có thể là một cách tiếp cận an toàn. Tuy nhiên, cần quan sát thêm về các biến chứng cấy ghép có thể được yêu cầu.

Kết luận, nghiên cứu lâm sàng dựa trên thử nghiệm lâm sàng đã cấy ghép các UCMSC allogeneic ở bệnh nhân mắc bệnh T2D. Sau hai lần tiêm truyền UCMSC, tất cả các bệnh nhân được nghiên cứu đều cho thấy sự cải thiện đáng kể về tình trạng bệnh tiểu đường, được biểu thị bằng sự thay đổi nồng độ C‑peptide và HbA1c. Ngoài ra, việc giảm nhu cầu insulin hoặc không còn phụ thuộc với insulin đã đạt được trong suốt thời gian theo dõi. Các tác dụng phụ tức thời và lâu dài trong việc truyền tế bào không được ghi nhận trong quá trình điều trị.

Lời cảm ơn

Nghiên cứu này được hỗ trợ bởi một khoản trợ cấp từ Quỹ phát triển khoa học và công nghệ của Weifang (số 201102009). Các tác giả xin gửi lời cảm ơn Tiến sĩ Chang ‑ Shan Liu và Tiến sĩ Lin Liu vì những gợi ý hữu ích của họ và rất cảm tạ Li Gao, Zhi Cui Liu, Nan Jia, Feng Fei Yu, Na Li và Gui ‑ Lan Ma vì đã hỗ trợ kỹ thuật cho bài viết này

LI-XUE GUAN1*, HUI GUAN2*, HAI-BO LI1, CUI-AI REN3, LIN LIU4, JIN-JIN CHU1 và LONG-JUN DAI1,5

Phòng thí nghiệm trung tâm, Bệnh viện Nhân dân Weifang, Cao đẳng y tế Weifang, Weifang, Shandong 261042;

Trường cao đẳng quản lý, Đại học Y khoa Weifang, Weifang, Shandong 261053; Khoa huyết học

Và Khoa Nội tiết, Bệnh viện Nhân dân Weifang, Đại học Y khoa Weifang, Weifang, Shandong 261042,

CHND Trung Hoa; 5Khoa phẫu thuật, Đại học British Columbia, thành phố Vancouver, BC V5Z 1L8, Canada, Tiếp nhận ngày 21 tháng 6 năm 2014; Phê duyệt ngày 11 tháng 2 năm 2015

DOI: 10.3892/etm.2015.2339

Recommended Posts

No comment yet, add your voice below!


Add a Comment

Your email address will not be published. Required fields are marked *